菌落總數測定操作步驟及注意事項

一、測定標準

參考食品國家標準：GB 4789.2-2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》。

二、操作過程

1、前期準備：

根據國家標準，提前準備好要用的平板計數瓊脂、平皿、試管、稀釋液（生理鹽水）、三角燒瓶等，相應的材料進行滅菌處理（幹熱滅菌或高壓滅菌）。

2、接收樣品：

收到樣品後，確認樣品包裝是否完好，登記樣品信息，並將其保存在2~8℃冰箱中，然後在取樣時取出。

3、樣品處理：

按照作業(ye) 指導書(shu) 操作，仔細閱讀實驗要求。一般實驗室收到的是幹粉樣品、固體(ti) 樣品、或者液體(ti) 樣品等。假如收到幹粉樣品，那麽(me) 首先需要將其配置成水溶液（即水化）。根據實驗要求及經驗，進行預判，預估稀釋液倍數，溶解即可。

4、實驗前準備：

4.1實驗操作最好在超淨台或者生物安全櫃裏操作，需要把超淨台或者生物安全櫃提前清理、消毒處理，確保實驗環境無菌。

4.2提前把要用到的平皿、試管、稀釋液等放到操作台上紫外殺菌。

5、實驗操作：

5.1稀釋

將樣品從(cong) 冰箱中取出達到室溫後開始取樣，在超潔淨台或者生物安全櫃下先用少許稀釋液（選取的生理鹽水）進行水化後吸入無菌瓶或袋中，再用剩餘(yu) 的稀釋液進行洗滌並全部轉入無菌瓶或袋中。

洗滌轉移時注意樣品瓶蓋的清洗和無菌操作，將全部的水化液進行均質混勻，一般作為(wei) 原液立刻進行接種；再取25ml到225ml稀釋液中均質混勻，製成10-1梯度樣品勻液。

用1ml無菌吸管取1:10的樣液到9ml生理鹽水試管中，製成1:100的樣液，以此類推。再將幾個(ge) 稀釋度的樣液接種到提前做好標記的無菌平皿中。

5.2傾(qing) 注平板

將提前在水浴鍋裏涼至46℃的平板計數營養(yang) 瓊脂培養(yang) 基注入平皿約15ml，並轉動平皿，混合均勻。同時將營養(yang) 瓊脂培養(yang) 基傾(qing) 入加有1ml稀釋液（不含樣品）的滅菌平皿內(nei) 作空白對照。傾(qing) 注過程一般左手拿平皿，右手拿瓊脂瓶，左手將平皿打開30°左右的縫隙，傾(qing) 注瓊脂大約到平皿底的二分之一處，左三圈、右三圈輕輕混勻，然後放到台麵上。待瓊脂凝固後，翻轉平板，置36±1℃溫箱內(nei) 培養(yang) 48±2h。

5.3觀察計數

24h觀察檢測結果有無異常現象，是否有蔓延菌落出現。48h再按照GB 4789.2的要求進行菌落計數。在對結果進行分析後，選取檢測結果的平均值為(wei) 最終數據。

三、注意事項

1、當無法預判樣品菌落總數含量時，需要梯度稀釋，此步驟尤其關(guan) 鍵，必須盡可能地減少誤差。

2、傾(qing) 注用培養(yang) 基應在46℃水浴內(nei) 保溫，溫度過高會(hui) 影響細菌生長，過低瓊脂易凝固，不能與(yu) 菌液充分混勻。如無水浴條件，應以皮膚感受較熱而不燙為(wei) 宜。

3、傾(qing) 注培養(yang) 基的量規定不一，從(cong) 12~20ml不等，一般以15ml較為(wei) 適宜，平板過厚會(hui) 影響觀察，太薄又易於(yu) 幹裂。傾(qing) 注時，培基底部如有沉澱物，應將底部棄去，以免與(yu) 菌落混淆而影響計數觀察。

4、傾(qing) 注過程力度一定掌握好，絕不能把瓊脂濺出來。

5、為(wei) 使菌落能在平板上均勻分布，檢液加入平皿時要盡可能放在中央部位，然後應盡快傾(qing) 注培養(yang) 基並旋轉混勻，可正反兩(liang) 個(ge) 方向旋轉，檢樣從(cong) 開始稀釋到傾(qing) 注最後一個(ge) 平皿所用時間不易過長，以防止細菌有所死亡或繁殖。

6、瓊脂培養(yang) 基放水浴鍋前一定要混合均勻，以防出現平皿不凝固現象；拿出傾(qing) 注時要用噴有75%酒精的抹布擦拭幹淨。

7、冷卻的過程不要著急，冷卻充分後再倒置放進培養(yang) 箱培養(yang) ，放置的時候要盡量避免放到風機口處，每摞不要超過6個(ge) 平皿。

8、檢測結束後所有的稀釋液樣品可放到冰箱裏0-5℃冷藏，以備實驗出錯時再用。

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