华体会彩票资料醫療新guan肺炎檢測PCR實驗室建設場景方案一 hth赞助曼联
自新型guan狀病毒發現以來，特別是PCR實驗室新型guan狀病毒核酸檢測工作任務艱巨。先介紹一下PCR檢測的流程：
1 試劑製備區
功能：主要是作為(wei) 貯存試劑的製備、試劑的分裝和主反應混合液的製備，試劑和用於(yu) 標本製作的材料應直接運送至該區，不得經過其它區域。試劑原材料需貯存在本區內(nei) ，並在本區內(nei) 製備成所需的貯存試劑。所需要的儀(yi) 器設備：
天平（用於(yu) 精確稱量各類試劑）→超淨工作台（涉及對細菌的操作均需在超淨工作台下完成）→移液器（準確量取特定體(ti) 積溶液20-100ul）→純水（超純水18.2ΩM.CM）→藥品冷藏箱（短期保存  ）→試劑低溫冰箱（可選2-8°、-20℃）→混勻儀(yi) （移取樣本前需要混勻）（推薦艾本森品牌：MixMax漩渦混勻儀(yi) ）→消毒車（空間環境消毒）→滅菌鍋（實驗室物品、試劑、培養(yang) 基消毒滅菌）→PH計（配置試劑是精確測量PH值）  
2 樣本製備區
功能：臨(lin) 床標本的保存、核酸(RNA、DNA)提取、貯存及其加入至擴增反應管和測定RNA時DNA的合成。所需要的儀(yi) 器設備
生物安全櫃（為(wei) 了防止有害懸浮微粒、氣溶膠的擴散）→樣本低溫冰箱（-20℃，-80℃保存樣本及DNA）→高速台式冷凍離心機（用於(yu) 收集微生物菌體(ti) 、細胞碎片以及其他沉澱物，有些樣品由於(yu) 在常溫下不太穩定，需要低溫環境）→恒溫金屬浴（用於(yu) DNA雜交過程中水浴控溫）（HtPot40恒溫金屬浴）→移液器（準確量取特定體(ti) 積溶液）→紫外燈或者消毒車（空間環境消毒）→混勻儀(yi) （移取樣本前需要混勻）（推薦艾本森品牌：MixMax漩渦混勻儀(yi) ）→超淨工作台（涉及對細菌的操作均需在超淨工作台下完成）→低溫搖床（用於(yu) 大腸杆菌和酵母菌的振蕩培養(yang) ）→磁力攪拌器(加速溶解固體(ti) 內(nei) 容物 )
3 核酸擴增區
功能：主要是DNA擴增，已製備的DNA模板和合成的DNA和主反應混合液，製備成反應混合液等，也可以在本區域內(nei) 進行。在PCR測定中，通常在擴增後須打開反應管。
基因擴增儀(yi)    （基因檢測DNA/RNA擴增）→熒光定量PCR儀(yi) （核酸定量分析）→核酸提取儀(yi) （樣品DNA/RNA提取）→移液器（準確量取特定體(ti) 積溶液）→紫外燈或者消毒車   （空間環境消毒）→超淨工作台（涉及對細菌的操作均需在超淨工作台下完成   ）→純水裝置（用於(yu) PCR，DNA測序需要超純水）
4 產(chan) 物分析區
功能：主要進行的操作為(wei) 擴增片段的測定，如使用全自動封閉分析儀(yi) 器檢測，需要儀(yi) 器設備：
基因擴增儀(yi)   （基因檢測DNA/RNA擴增）→熒光定量PCR儀(yi) （核酸定量分析）→核酸提取儀(yi) （樣品DNA/RNA提取）→移液器（準確量取特定體(ti) 積溶液）→紫外燈或者消毒車 （空間環境消毒）→超淨工作台（涉及對細菌的操作均需在超淨工作台下完成   ）→純水裝置（用於(yu) PCR，DNA測序需要超純水 電泳儀(yi) （水平電泳用於(yu) 核酸DNA/RNA檢測，垂直電泳用於(yu) 蛋白檢測，轉印電泳用於(yu) 將蛋白轉印到膜上做western檢測）→凝膠成像係統/紫外檢測儀(yi) （用於(yu) 核酸瓊脂電泳和蛋白聚丙酰胺的觀察和拍照，紫外分析儀(yi) 用於(yu) 染色後核酸瓊脂電泳膠觀察，不能連接電腦）→電爐（電泳瓊脂凝膠加熱融化）

新型guan狀病毒（2019-nCov）核酸檢測流程
北京協和醫院近期發布了《新型guan狀病毒核酸檢測》標準操作流程。這為(wei) 我們(men) 建設2019-nCov新型guan狀病毒P3實驗室建設提供了科學指導。
（PCR核酸檢測實驗室布局建設 SICOLAB）
具體(ti) 檢測流程如下
一、核酸檢測前的生物安全防護（工作人員個(ge) 人三級防護的穿戴）
1、穿戴流程：
在基因擴增實驗室的清潔區（更衣區）或者普通實驗室的潔淨區，工作人員按順序依次穿戴好一次性帽子、醫用N95、一次性防hu服、一次性鞋套、一次性防水靴套、防護目鏡和雙層乳膠手套，進入樣本處理工作區域或實驗室。
2、要點提示：
2.1、具備標準基因擴增布局條件的實驗室，應在清潔更衣區做好個(ge) 人三級防護，條件有限的實驗室亦可選擇在一潔淨的實驗室中按流程穿戴好個(ge) 人三級防護。
2.2、需佩戴醫用N95，若無醫用N95，可以考慮用普通N95/KN95外加一次性外科的組合方式，但不要佩戴有呼吸閥的N95。
2.3、佩戴N95時需檢查密閉性，通過雙手按壓、深呼吸、左右轉頭等動作嚴(yan) 格檢查是否佩戴正確。
2.4、一次性防hu服已具備新型guan狀病毒核酸檢測的防護需求，有條件時可以考慮加穿一次性反穿隔離衣，穿衣時需由他人協助。
2.5、穿戴整齊的工作人員，應按要求盡快進入樣本處理的實驗區域開展工作，嚴(yan) 禁穿戴三級防護後再進入普通實驗區域或辦公區域。

二、樣本的滅活處理
1、操作流程：
兩(liang) 名完成三級防護的工作人員，進入樣本處理區或樣本處理實驗室，將接收到的樣本二級包裝在安全櫃內(nei) 打開，檢查樣本主容器是否為(wei) 嚴(yan) 格密閉；對密封袋表麵進行消毒後，對送檢樣本進行56℃下30分鍾的滅活，滅活後的樣本管需在生物安全櫃內(nei) 打開內(nei) 層的容器，將拭子保存液混勻後進行分裝和用於(yu) 核酸提取。
2、要點提示：
2.1、涉及高致病性病原微生物的實驗室活動，需由兩(liang) 名工作人員完成，其中一人負責主要實驗操作，一人提供必要的協助。主操作者應避免反複多次進出安全櫃。
2.2、滅活形式：可以采用水浴或空氣加熱形式完成滅活，采用空氣加熱時可適當延長滅活時間。有條件時可以采用小型化設備在安全櫃內(nei) 操作，減少樣本進出安全櫃的次數。滅活前的樣本嚴(yan) 禁在生物安全櫃外打開和操作。
2.3、應特別檢查采樣管是否擰緊、有無樣本溢漏等情況。
2.4、樣本管每次進出安全櫃均需對外表麵進行消毒。
2.5、應就近配備適量的消毒處理物品，以防止實驗操作過程中可能發生的意外溢灑事故，有條件時建議在安全櫃內(nei) 配備一次性吸水台布。
三、樣本的核酸提取
1、手工核酸提取操作流程（以凱傑的52906柱提法核酸提取試劑盒為(wei) 例）
1.1、裂解液配製：在基因擴增實驗室的試劑配製區或單獨的普通試劑配製實驗室中，準備核酸提取所需的洗液1（AW1）、洗液2（AW2）和carrier RNA。按照要求，分別向洗液1和洗液2中加入分子生物學級別的130ml和160ml的無水乙醇並及時做好標記；取310μl洗脫液（AVE）溶解310μg/支的Carrier RNA。配置好後，通過傳(chuan) 遞窗進入核酸提取區或由工作人員送入核酸提取實驗室。
1.2、樣本裂解：取560μl AVL裂解液到1、5ml無菌EP管中，加入5、6μl配製好的Carrier RNA，再加入已經滅活的140μl樣本（例如咽拭子、血漿等），混勻振蕩15秒，室溫靜置10分鍾，充分裂解樣本中的核酸。將EP管瞬時離心後加入560μl無水乙醇，充分混勻15秒，再次瞬時離心後備用。吸取630μl裂解產(chan) 物，小心加入至離心柱中，8000rpm（或6000g）離心1分鍾，轉移離心柱至新收集管，將剩餘(yu) 630μl裂解產(chan) 物加到離心柱中，重複上一離心操作（若樣本體(ti) 積大於(yu) 140μl，則在此步驟重複將630μl裂解產(chan) 物過濾收集在一個(ge) 離心柱上）。
1.3、核酸的洗滌：取500μl洗液1（AW1）至離心柱中，8000rpm（或6000g）離心1分鍾；換新收集管後，取500μl洗液2（AW2）至離心柱中，8000rpm（或6000g）離心1分鍾；換新收集管後，用14000rpm（或20000g）離心3分鍾，去除洗液2（AW2）；換新收集管後，繼續用離心機大轉速（20000g）離心1分鍾，充分甩離殘留的洗液2（AW2）。
1.4、核酸的洗脫和回收：取一1、5ml無菌EP管，將離心柱放入其中，加入洗脫液（AVE）40~60μl，室溫靜置1分鍾後，用8000rpm離心1分鍾回收核酸，以備PCR檢測使用。
1.5、要點提示：
（1）、新鮮裂解液的配製應盡可能在專(zhuan) 門的潔淨區域或單獨的實驗室進行。
（2）、要用分子生物學級別的無水乙醇試劑進行配製。
（3）、向離心柱中加入裂解產(chan) 物、洗液時操作要非常小心，盡量將洗頭下探到離心柱內(nei) 部後靠管壁加樣，切忌出現溢灑後汙染到離心柱的密封圈，這可能會(hui) 導致乙醇殘留，抑製後續PCR反應。
（4）、從(cong) 離心機中取出離心柱時應小心操作，避免離心柱下緣被收集管中的濾過殘液汙染。
（5）、加入洗液2（AW2）後的第二次空管全速離心非常關(guan) 鍵，能幫助充分甩離離心柱濾膜中殘留的洗液2殘液，確保洗脫核酸的純度。
（6）、洗脫液加樣時需小心操作，確保洗脫液盡可能覆蓋全部離心柱濾膜，充分洗脫核酸，提高核酸提取的產(chan) 量。
（7）、手工核酸提取可優(you) 選使用檢測試劑盒說明書(shu) 推薦的配套手工提取試劑，也可選用通用手工提取試劑。
（8）、樣本處理過程中，工作人員覺得有必要時，應隨時更換新的外層乳膠手套。
2、采用核酸提取儀(yi) 提取核酸的操作流程
根據核酸提取儀(yi) 和試劑的說明書(shu) 準備好提取試劑，取200μl樣本上機提取核酸，並按照要求回收提取好的核酸備用。
要點提示：
1、不同的提取儀(yi) 器和試劑的提取效率可能存在差異，請一定嚴(yan) 格按照提取試劑盒的說明書(shu) 進行核酸提取操作。
2、有條件時可以考慮配備小型化的核酸提取儀(yi) 在安全櫃內(nei) 使用，以進一步加強生物安全防護；若使用在安全櫃外的核酸提取儀(yi) ，則一定要做好生物安全防護及樣本的防汙染保護。
四、PCR體(ti) 係的配製和模板加樣
1、操作流程：
在基因擴增實驗室的試劑配製區或單獨的實驗室，配製PCR體(ti) 係。根據試劑盒說明書(shu) 的要求，將試劑盒的不同組分（一般包括反應液、酶、引物等）按照各自必須的體(ti) 積量進行配製混合，充分混勻並離心後，通過傳(chuan) 遞窗傳(chuan) 遞到核酸提取和加樣區，或由專(zhuan) 人從(cong) 試劑配製實驗室送至核酸提取和加樣實驗室。在加樣生物安全櫃內(nei) ，根據檢測樣本例數分裝體(ti) 係到每個(ge) 反應管中，逐一將樣本核酸加入到對應的反應管中，並加蓋密閉好PCR反應管；每批次檢測需要做一個(ge) 陽性對照和3個(ge) 陰性對照。
2、要點提示：
（1）、試劑配製必須嚴(yan) 格在試劑配製區或單獨、潔淨的實驗室和安全櫃內(nei) 進行，以確保試劑不會(hui) 有被汙染的可能。
（2）、試劑配製時要根據檢測樣本數量進行合理配製，每批次檢測均需要包括3個(ge) 陰性對照和1個(ge) 陽性對照的試劑，同時還需要考慮試劑分配過程中的正常損耗等消耗。
（3）、加樣可以和樣本處理/核酸提取在同一分區或同一間實驗室進行，但如有條件hao在單獨的加樣區或至少使用安全櫃進行加樣。
（4）、體(ti) 係分裝建議每次更換新的吸頭，避免反複使用帶來體(ti) 積誤差和交叉汙染。
（5）、應配置體(ti) 係加樣登記表，確保加樣過程準確無誤。
（6）、PCR密閉管蓋應特別謹慎，建議更換新的手套，防止手套等接觸管蓋內(nei) 部帶入汙染的風險。

五、上機檢測及結果分析
1、操作流程：
在擴增區或擴增實驗室，由專(zhuan) 人取出配製好的PCR檢測管，混勻、離心後，小心上機檢測，按照試劑盒說明書(shu) 設置擴增參數並分析判讀結果。進行結果分析時，應認真閱讀試劑盒說明書(shu) ，在了解該試劑盒的靈敏度、檢測方法和局限性等技術特點的基礎上，結合該批次陰性質控的結果，綜合判讀樣本的檢測結果。檢測結束後，為(wei) 防止可能的擴增汙染，擴增結束後的PCR管嚴(yan) 禁開蓋或帶離擴增實驗室，應盡快通過可密封塑料袋等容器盛裝密閉後，放入醫療垃圾桶中做進一步處理。
2、要點提示：
（1）、因基因擴增區存在汙染的風險，應設專(zhuan) 門的擴增區域或在單獨的實驗室進行擴增，必須和核酸提取、試劑配製區域有嚴(yan) 格的物理分割。
（2）、不同操作區域的工作服不要混穿，特別是基因擴增區的工作服，建議僅(jin) 在擴增區域或擴增實驗室內(nei) 使用。
（3）、熟悉檢測用PCR儀(yi) 器的基本性能和特點，能客觀分析判斷檢測結果。
六、檢測後的消毒處理
1、操作流程：
（1）、生物安全櫃內(nei) ：在完成樣本核酸提取後，應在安全櫃內(nei) 用75%消毒酒精對外層手套進行消毒處理，並將外層手套取下後棄至安全櫃內(nei) 的垃圾桶中。小心收納並丟(diu) 棄使用過的一次性吸水台布，用0、5%~1%的有效氯消毒劑或75%酒精擦拭安全櫃台麵、移液器等安全櫃內(nei) 全部儀(yi) 器的表麵。將安全櫃內(nei) 產(chan) 生的新型guan狀病毒相關(guan) 醫療垃圾經3層包裝後，轉移至實驗室的醫療垃圾桶中。開啟紫外燈照射生物安全櫃，時間應大於(yu) 30分鍾。
（2）、樣本核酸提取工作人員實驗室內(nei) ：他人協助用0、5%~1%的有效氯消毒劑或75%酒精均勻噴灑內(nei) 層手套、袖口、手臂及隔離衣後，將外層反穿隔離衣脫下至新型guan狀病毒醫療垃圾桶中送高壓處理。
（3）、樣本處理實驗室內(nei) ：用0、5%~1%的有效氯消毒劑或75%酒精消毒實驗室台麵和地麵；開紫外燈進行大於(yu) 30分鍾的空間消毒。
（4）、工作人員摘脫三級防護：在緩衝(chong) 區戴新的外層手套，摘護目鏡置於(yu) 75%酒精浸泡消毒，從(cong) 頭開始，自上而下、由內(nei) 而外緩慢翻轉脫下一次性防hu服，直到將一次性防水靴套全部脫下，將防hu服置於(yu) 新型guan狀病毒醫療垃圾桶中送高壓處理。摘kouzhao、帽子、內(nei) 層鞋套和內(nei) 層手套後同樣置於(yu) 新型guan狀病毒醫療垃圾桶中送高壓處理。
（5）、新型guan狀病毒相關(guan) 醫療垃圾：所有新型guan狀病毒相關(guan) 醫療垃圾均需經濕熱高壓滅菌後再作為(wei) 普通醫療垃圾處理，且垃圾袋上應標注新型guan狀病毒醫療垃圾的相關(guan) 信息。高壓處理前後的垃圾要嚴(yan) 格區分，在高壓滅菌區域對新型guan狀病毒醫療垃圾進行濕熱高壓滅菌處理，高壓參數為(wei) 121℃、30分鍾。高壓要做物理、生物指示，以確保高壓滅菌的效果。
2、要點提示：
（1）、生物安全櫃內(nei) 是風險gao區域，操作者的外層手套經消毒後必須脫在安全櫃內(nei) 。
（2）、靴套或鞋套的主要作用是對操作者的腳和腿部進行防護，要求必須防水，以確保在實驗室內(nei) 發生意外遺灑時可隔離汙染。
（3）、核酸提取儀(yi) 內(nei) 部、生物安全櫃內(nei) 部和實驗室空間均應進行紫外線消毒，但紫外線對空氣的消毒效果好，對物體(ti) 表麵的消毒效果隨距離變遠而減弱，故在紫外線消毒前，仍需對各種儀(yi) 器表麵、台麵、地麵用消毒劑進行擦拭消毒。
（4）、工作人員在摘脫個(ge) 人三級防護後，仍應參照實驗室原有實驗後操作流程進行嚴(yan) 格認真的常規消毒處理，特別是實驗後的手衛生環節。
以上為(wei) SICOLAB整理，實驗室整體(ti) 設計建設工程、生物樣本建設工程、GMP環境建設工程、環保工程。